上海富衡生物科技有限公司

人脐血间充质干细胞培养流程

2019-08-22

1. 准备:MSC 细胞培养基配制:MSC 专用基础培养基 440 ml+FDCC 胎牛血清 50 ml+青霉素 5 ml+谷氨酸盐 5 ml(一般分装成 10 管 50 ml,后考虑 1 株仅传 3~5 代约需最多 5 管)。并于培养室内提前准备 T25 培养瓶、15 ml 离心管、50 ml 离心管、一次性塑料移液管,培养室外准备帽子、口罩、手套、烧杯、记号笔等准备带入。提前确保超净台和水浴锅以及 37 度培养箱、4 度离心机可供使用。

2. 解冻:预冷 4 度离心机,先将东西带进培养室,而后超净台消毒,打开水浴锅预热,将 1 管配好的 MSC 培养基预热。从 -80 度冰箱迅速取出冻存的细胞株,将冷冻管立即放入 37 ℃ 水浴锅中快速解冻,轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化。 

3. 种瓶:酒精棉球消毒外表面,然后打开此冻存管,用无菌移液管移至 15 ml 离心管中,吸取 1 ml(此时的培养基是复苏细胞用,最好不预热,减少 DMSO 对细胞损伤)MSC 培养基加入冻存管中轻吹打以吸取残余的细胞至离心管中,用 1 ml 大枪在离心管中均匀吹打至无沉淀,但亦要无气泡,拿至 4 度离心机在 250 g 转速下离心 5 min,回超净台吸走上清(宁可残留部分上清液也不要戳入底部细胞团中),再加入 2~3 ml 预热的 MSC 培养基轻柔重悬细胞,保证细胞分布均匀(无气泡),用移液枪将离心管中的细胞悬液移到竖立的干净 T25 培养瓶中,然后酒精棉球擦口后封口放倒前后左右平移保证其在瓶底面均匀铺开(但不要碰到瓶口三角区以防后续污染)。记号笔标记,5% 浓度 CO2 下 37 度孵育过夜。

4. 种瓶后首次换液:先预热培养基,消毒台面,而后从温箱中取出培养瓶,先镜下观察粗估悬浮以及贴壁细胞比例,而后回台面用一次性塑料移液管吸尽上清,再加加入 4 ml 预热好的 MSC 培养基,酒精棉球消毒瓶口,封口后送入温箱。

5. 后续换液:每 2~3 天换液一次,视细胞量而定,频繁换液不利于细胞对于二氧化碳摄入。

6. 传代:细胞生长达 70% 融合即可进行
(1)消毒台面,预热培养基,1 × PBS 以及胰酶至 37 度
(2)从原培养瓶中吸走废液
(3)将预热的 PBS 加 3 ml 至培养瓶中,注意加时不要冲到细胞层那面瓶壁,轻柔漂洗,再弃去 PBS,重复此步 1 次
(4)吸尽 PBS 加入 0.5~1 ml 0.25% 胰酶进行消化,镜下观察待细胞变圆即将脱落时立即拿到超净台吸去消化液,再加入预热的培养液轻轻吹打至细胞脱落
(5)分多次将细胞悬液移至 15 ml 离心管中,残余细胞也用培养基洗下来一并加入。
(6)250 g 离心 5 min
(7)至超净台吸走上清,加入细胞培养基,吹打重悬
(8)向两个 T25 培养瓶中分别加入 2 ml 培养基,消毒瓶口后封口标记,送入温箱(具体可视消化后细胞稠密度大致决定分几瓶)

7. 种板:对于 MSC 细胞当传到第 3 代或第 4 代时种板最佳,第 6 代起细胞变的肥大基本贴壁及增殖能力就很弱了,不容易抵挡种板这一损伤最大的细胞事件,消化前细胞分布约占每视野的 70% 以上,超过 90% 则提示传代晚了。

(注:我们一般对含因子较多的培养基不反复预热,只需提前取出接近室温即可使用,反复预热对因子破坏大)

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